Trasformazione batterica

Modifica genetica di cellule batteriche


La trasformazione batterica è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per introdurre materiale genetico in cellule batteriche. La trasformazione permette di ottenere una maggiore quantità di un prodotto proteico il cui gene viene inserito artificialmente in cellule batteriche. E' possibile trasformare in maniere analoghe anche cellule eucariotiche.
Per lo scopo vengono generalmente utilizzati plasmidi, molecole di DNA circolare a doppio filamento su cui viene inserito il gene di interesse.

Plasmide con indicati i punti di taglio di diversi enzimi di restrizione. Da notare il gene Amp per la resistenza alle penicilline (ampicillina) e la sequenza origine di replicazione

I plasmidi hanno lunghezze variabili da 1 a 200Kb, sono presenti in natura in numero variabile di copie in cellule batteriche, con capacità di replicazione autonoma indipendente dal DNA genomico del batterio. Spesso contengono geni che conferiscono un vantaggio ai batteri che li possiedono (resistenza ad antibiotici, produzione di batteriocine in grado di uccidere altri batteri, fermentazioni di zuccheri, sintesi di enterotossine, resistenza a metalli pesanti, sistemi di restrizione-modificazione del DNA, degradazione di composti aromatici...). In genere si utilizzano per la trasformazione batterica dei plasmidi dotati di un gene per la resistenza a antibiotici (Amp gene per la resistenza all'ampicillina, produce la proteina beta-lattamasi in grado di spezzare l'anello lattamico delle penicilline, inattivandole) e una zona su cui possono tagliare enzimi di restrizione (per il taglio del plasmide e l'inserimento del gene che si vuole veicolare nei batteri). Indispensabile inoltre è la sequenza Ori, origine di replicazione, punto di inizio per la replicazione autonoma del plasmide una volta al'interno dei batteri (grazie alla DNA polimerasi batterica).

I batteri più utilizzati a tale scopo sono Escherichia Coli. I Coli sono batteri commensali dell'intestino, vengono utilizzati preferenzialmente in quanto hanno una elevata capacità di duplicazione (ogni 20 minuti a 37C in presenza di nutrienti fanno scissione binaria) e sono facilmente eliminabili con disinfettanti. Escherichia Coli sono batteri Gram negativi.

Per effettuare la trasformazione batterica,  le tecniche più utilizzate sono:

-Elettroporazione: Le cellule in miscela col plasmide sono sottoposte a stimolazioni elettriche ad alto voltaggio che destabilizzano la membrana plasmatica e inducono la formazione di pori transienti del diametro di alcuni nanometri, attraverso cui possono passare molecole di DNA. Questa tecnica ha una efficacia maggiore ma richiede una quantità superiore di plasmide (l'ingresso del plasmide avverrebbe infatti solo per diffusione passiva attraverso i pori) e un costo anche maggiore di apparato.

-Cloruro di calcio: i batteri sono trattati a lungo con soluzioni di calcio cloruro (vengono così detti batteri competenti in quanto in grado di ricevere il plasmide). Infatti la membrana esterna dei Coli ha una carica negativa conferita dai gruppi lipopolisaccaridici esterni. Questa respingerebbe la carica negativa del DNA plasmidico. Gli ioni calcio mascherano le cariche negative della membrana esterna, e hanno anche il vantaggio di legarsi alle calcio-porine, proteine canale di membrana dei batteri, con l'effetto di allargarne le dimensioni. Questa seconda metodica ha una efficacia inferiore ma costi molto minori rispetto alla elettroporazione.
Dopo trattamento con cloruro di calcio, batteri competenti e plasmide sono messi in miscela in ghiaccio, quindi posti a bagnomaria a 42C per 90 secondi, dopo i quali di nuovo ghiaccio per alcuni minuti. In questo passaggio, detto shock termico, l'energia cinetica del bagno termostatato fa scontrare plasmide e batteri competenti rendendo possibile la trasformazione, ossia il passaggio del plasmide dentro la cellula attraverso le porine.

La percentuale di cellule batteriche così trasformate è mediamente molto scarsa (circa 1 su 10000). I batteri vengono fatti crescere a 37C in terreno di coltura liquido per mezz'ora circa, il tempo di un ciclo di replicazione dei batteri (trasformati e non). In questo tempo i batteri trasformati hanno modo di produrre la resistenza all'antibiotico (beta-lattamasi). A questo punto vengono seminati in piastre petri contenenti terreno di coltura arricchito di ampicillina, che permette di eliminare i batteri non trasformati, selezionando in questo modo solo i batteri ogm che hanno acquisito il plasmide.

La coltura batterica così ottenuta si duplica in cloni che contengono anch'essi copie del plasmide, in grado di autoreplicarsi all'interno della cellula, e produce la proteina il cui gene è stato inserito nel plasmide. La proteina viene recuperata mediante successiva lisi della coltura di cellule batteriche e purificazione secondo adatta metodica (cromatogafia di affinità, cromatografia idrofobica, elettroforesi...)

Alcune proteine di interesse farmaceutico prodotte secondo la tecnica del DNA ricombinante sono interferone, insulina, glucagone, ormone della crescita, eritropoietina, fattori plasmatici e della coagulazione, fattori di riparazione di ulcere e ferite, vaccino per l'epatite B, regolatori del metabolismo del calcio, regolatori dell’immuno-ematopoiesi. E' possibile ovviamente produrre in questa maniera solo molecole proteiche.